Скоблов михаил юрьевич. Структура и особенности регуляции генов гомологов RFP2 у человека и мыши Скоблов Михаил Юрьевич

Типы регуляции активности генов у прокариотов Репрессия и индукция синтеза белков у прокариотов реализуют принципы адаптации к меняющимся условиям существования и клеточной экономии: ферменты появляются в клетках, когда в них существует потребность, и перестают вырабатываться, если потребность исчезает. Экспрессируемые гены можно поделить на следующие категории: конститутивные, присутствующие в клетках в постоянных количествах независимо от метаболического состояния организма индуцируемые, их концентрация в обычных условиях мала, но может возрастать в 100 раз и более, если, например, в среду культивирования клеток добавить субстрат такого фермента; репрессируемые, т. е. ферменты метаболических путей, синтез которых прекращается при добавлении в среду выращивания конечного продукта этих путей.

Регуляция транскрипции у прокариот Оперон - функциональная единица генома у прокариот, в состав которой входят цистроны (гены, единицы транскрипции), кодирующие совместно или последовательно работающие белки и объединенные под одним (или несколькими) промоторами. Опероны по количеству цистронов делят на моно-, олиго- и полицистронные, содержащие, соответственно, только один, несколько или много цистронов (генов). Концепцию оперона для прокариот предложили в 1961 году французские ученые Жакоб и Моно, за что получили Нобелевскую премию в 1965 году. Структура лактозного оперона Франсуа Жакоб Жак Люсьен Моно

Механизм работы лактозного оперона Клетки Е. coli обычно растут на среде, используя в качестве источника углерода глюкозу. Если в среде культивирования глюкозу заменить на дисахарид лактозу, то клетки адаптируются к изменившимся условиям, начав синтез трёх белков, обеспечивающих утилизацию лактозы. Один из этих белков - фермент β-галактозидаза, катализирующий гидролитическое расщепление лактозы до глюкозы и галактозы

Механизм работы лактозного оперона a) В отсутствие индуктора (лактозы) белок-репрессор связан с оператором. РНКполимераза не может присоединиться к промотору, транскрипция структурных генов оперона не идёт b) В присутствии лактозы белок-репрессор присоединяет её, изменяет свою конформацию и теряет сродство к оператору. РНК-полимераза связывается с промотором и транскрибирует структурные гены.

Репрессия синтеза белков. Триптофановый оперон. Выше описана система регуляции триптофанового оперона по принципу вкл/выкл. Эта система реагирует на различные концентрации триптофана, изменяя скорость синтеза ферментов биосинтеза в 700 -кратном диапазоне Как только репрессия ослабляется и начинается транскрипция, скорость транскрипции регулируется вторым более тонким регуляторным процессом называемым транскрипционная аттенюация (transcription attenuation - транскрипционное ослабление). Транскрипционная аттенюация описана как процесс, в котором транскрипция инициируется как обычно, но резко останавливается перед транскрибирующимся опероном генов. Частота, с которой транскрипция «ослабляется» зависит от имеющейся концентрации триптофана. Основой данного механизма, разработанной Чарльзом Янофски, является очень сильная связь между транскрипции и трансляции у бактерий.

Терминация транскрипции у прокариот Терминация транскрипции может осуществляться по двум вариантам: Rho-зависимая терминация контролируется Rho белком фактор Rho связывается с растущей цепью РНК в местах p-зависимой терминации транскрипции РНК- полимераза прекращает элонгацию белок Rho дестабилизирует водородные связи между матрицей ДНК и м. РНК, высвобождая молекулу РНК Rho-независимая терминация Контролируется последовательностью в ДНК-матрице РНК-полимераза доходит до CGбогатого участка Синтезированная молекула РНК формирует стебель-петлю, за которой расположено несколько урацилов, что приводит к отсоединению молекулы РНК от матрицы ДНК.

Репрессия синтеза белков. Триптофановый оперон. В лидерном пиптиде фенилаланино вого оперона среди 15 остатков 7 остатков фенилаланина, а в лидерном пиптиде гистидинового оперона - 7 подряд остатков гистидина.

Регуляция SOS-ответа SOS-ответ представляет собой индуцируемую реакцию клеток на резкую остановку синтеза ДНК, вызванную повреждением ДНК, голоданием клетки или другими стрессовыми факторами. Это реакция клетки на критическое состояние, приближающее ее к гибели. Ключевыми регуляторными элементами являются Репрессор Lex. A регулирующий транскрипцию всех SOS генов Белок Rec. A способный связываться с одноцепочечной ДНК Комплекс Rec. A-ss. DNA приводит к индукции SOS ответа, способствуя удалению Lex. A путём его авторасщеплению на два белковых фрагмента

Зачем нужна регуляция эукариотам? В организме человека имеется минимум 400 различных типов клеток, существенно различающихся по структуре и функциям

Зачем нужна регуляция эукариотам? Количество клеток в организме человека - около 100. 000 (100 триллионов, или 1014). При рождении человека в мозгу насчитывается около 14 миллиардов клеток. Это количество не увеличивается до самой смерти. После того, как человеку исполняется 25 лет, ежедневно происходит сокращение количества клеток мозга на 100 тысяч.

Гены транскрибируются на разном уровне в разных тканях Если взять любую ткань, то мы увидим, что половина генов человека вообще в ней не экспрессируется, а другая половина имеет следующее распределение по уровням экспрессии

Разница между прокариотами и эукариот Прокариоты Эукариоты Структура генома Простая, в основном кольцевой геном Организован в хромосомы, нуклеосомная структура определяет доступность ДНК Размер генома Относительно небольшой Относительно большой Локализация транскрипции и трансляции Совмещённая Ядерная транскрипция и цитоплазматическая трансляция Организация генов Оперонная Оперонов в эукариотах не найдено. Каждый ген имеет собственный промотор и регулирующие элементы Статус транскрипции по умолчанию Вкл Выкл

Транскрипция у эукариот Транскрипционные факторы (ТФ) могут влиять на транскрипцию генов через несколько механизмов: В литературе на сегодняшний день описано 1762 ТФ у человека. В большинстве случаев изученных к настоящему времени ТФ стимулируют формирование комплекса преинициации на TATA- боксе за счет взаимодействия их транс- активирующих доменов с компонентами базального транскрипционного комплекса (либо непосредственно, либо через коактиваторы/ медиаторы). Некоторые ТФ вызывают изменения структуры хроматина, делая его более доступным для РНК-полимераз. Другие ТФ являются вспомогательными, создавая оптимальную конформацию ДНК для действия других транскрипционных факторов. Известны ТФ, которые подавляют транскрипцию за счет непосредственного действия своих ингибирующих доменов, либо нарушая совместное функционирование комплекса транскрипционных факторов внутри регуляторной области гена (промотора, энхансера).

Транскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Для гена Mir 155 в B -клетках было найдено 83 взаимодействий промотора гена с различными энхансерами. Распределение выявленных взаимодействий «промотор-энхансер»

Транскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Interactome maps of mouse gene regulatory domains reveal basic principles of transcriptional regulation. Kieffer-Kwon KR, Tang Z, Mathe E, Qian J, Sung MH, Li G, Resch W, Baek S, Pruett N, Grøntved L, Vian L, Nelson S, Zare H, Hakim O, Reyon D, Yamane A, Nakahashi H, Kovalchuk AL, Zou J, Joung JK, Sartorelli V, Wei CL, Ruan X, Hager GL, Ruan Y, Casellas R. Cell. 2013 Dec 19; 155(7): 1507 -20.

Транскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Транскрипционная регуляция определяет когда должна произойти транскрипция и как много РНК должно быть синтезировано. Транскрипционные факторы Энхансеры Сайленсеры Инсуляторы Организация и статус хроматина Модификации гистонов ДНК-метилирование

Эпигенетика - область генетики, изучающая механизмы наследственности и изменчивости, в основе которых НЕ лежит изменение первичной последовательности ДНК и РНК. (С. Г. Инге. Вечтомов 2004 г.) Эпигенетическая регуляция – процесс, приводящий к изменению активности гена без изменений в его кодирующей последовательности, которое стабильно наследуется после исчезновения фактора, вызвавшего это изменение. «Эпи» - в переводе с греческого «над» .

Эпигенетика Термин «эпигенетика» был введен в 40 -х годах XX столетия для описания изменений экспрессии генов в ходе развития. Английский исследователь Уоддингтон подвергал куколок дрозофил тепловому шоку и наблюдал изменение паттернов жилкования крыльев у взрослых мух. Измененные фенотипы воспроизводились в популяции на протяжении долгого времени после устранения индуцировавшего их стимула, что дало возможность предположить, что воздействие определенного средового фактора на протяжении критических периодов развития может продуцировать фенотипические изменения, которые сохраняются на протяжении всей жизни и даже могут переходить в последующие поколения. Уоддиктон назвал этот феномен «генетической ассимиляцией» . В современной литературе чаще используют термин «эпигенетика» .

Эпигенетика В 1957 году Конрад Халл Уоддингтон сформулировал концепцию «эпигенетического ландшафта» . Процесс онтогенеза (индивидуальное развитие организма) - это пространство возможностей, "эпигенетический ландшафт", представляющий собой набор эпигенетических траекторий, ведущих от зиготы к взрослому состоянию организма. Эпигенетические траектории в некоторой степени связаны между собой. Под воздействием различных факторов (внутренних и внешних, генетических и негенетических) возможен переход с одной траектории на другую, в связи с чем, на основании одной и той же генетической программы возможно формирование множества траекторий онтогенеза (поливариантность онтогенеза). Траектории, получающие преимущество, Уоддингтон называл креодами.

Метилирование ДНК – основной способ передачи эпигенетической информации у растений и млекопитающих Не нарушает способность комплементарному взаимодействию, но стабилизирует двойную спираль ДНК и распознается многочисленными белками

Метилирование цитозина и аденина Цитозин метилируется значительно чаще, чем аденин Может происходить ферментов “спонтанно” без участия Наиболее эффективно “спонтанно” метилируется цитозин в мотиве Cp. G

Распространенность метелирования у разных организмов Объект М. musculus H. sapiens Растения Насекомые (D. melanogaster) С. elegans S. cerevisiae N. crassa Наличие метилирования есть незначительно роль неизвестна нет есть

Частоты динуклеотидов у человека Frequencies of dinucleotides in human 10. 00 9. 00 8. 00 7. 00 6. 00 5. 00 4. 00 3. 00 2. 00 1. 00 0. 00 AA AT AG AC TA TT TG TC GA GT GG GC CA CT CG CC Part of human dinucleotides different from a chimpanzee 25. 00 20. 00 15. 00 10. 00 5. 00 0. 00 AA AT AG AC TA TT TG TC GA GT GG GC CA CT CG CC студентка третье курса ФМБФ МФТИ Светлана Овчинникова

Дезаминирование метилированого цитозина В результате “спонтанного” дезаминирования метилированного цитозина возникает тимин, что приводит к мутации, закрепляемой при репликации ДНК То же самое происходит в геномах in vivo, результат – элиминация мотивов Cp. G (у растений – Cp. Np. G)

Cp. G островки Определения Cp. G островка: Frommer (1987) Any stretch of DNA greater than 200 bp with a GC content of greater than 50% and an observed to expected Cp. G ratio of greater than 0. 5 Takai (2002) Any stretch of DNA greater than 500 bp with a GC content of greater than 55% and an observed to expected Cp. G ratio of greater than 0. 6 >200 пн, длина большинства островков - 0. 5 -3 т. п. н. Относительно высокий GC-состав (>50, обычно>60%), плотное расположение мотива Cp. G (один на 10 пн, в 10 -20 раз выше, чем в среднем по геному) и его статистическая встречаемость Как правило, содержат мотивы CCGCCC (сайты связывания транскрипционного фактора SP 1) У человека - около 45000 островков. 60% генов имеют с своём локусе Cp. G как минимум один остров. Практически у всех генов “домашнего хозяйства”.

Свойства Cp. G островков Cp. G островки располагаются с основном в промоторах и 5’ районах генов Также часто распространнены и внутригенные, не захватывающие старт транскрипции Существую и межгенные Cp. G островки

Свойства Cp. G островков Cp. G-островки либо гипометилированы гиперметилированы, либо Cp. G в промоторах обычно неметилированы, что необходимо для транскрипции соответствующего гена (метилирование, как правило, приводит к блоку транскрипции) Установленный статус метилирования, как правило, стабилен и в дальнейшем поддерживается.

Механизмы репрессии транскрипции, обусловленной метилированием. Прямой механизм 1. Метильные группы нарушают ДНК-белковые взаимодействия, выступая в большую бороздку ДНК и препятствуя связыванию специфических транскрипционных факторов. 2. Некоторые ТФ наоборот имеют повышенное сродство к метилированным сайтам. Чувствительные к метилированию AP-2, E 2 F, NFk. B, CREB, Myc/Myn Нечувствительные к метилированию SP-1, CTF Опосредованный механизм 3. Метилированные районы ДНК связывают MBD (methyl binding domain) – содержащие белки, привлекающие транскрипционные репрессоры или белки, модифицирующие гистоны. – Большинство MBD содержащих белков – репрессоры или корепрессоры транскрипции. – У Arabidopsis сущ. 12 MBD – содержащих белков. – МBD – содержащие белки могут формировать комплексы с деацетилазами гистонов (репрессорами).

В клетках млекопитающих действуют по крайней мере две системы метилирования, за которые отвечают разные метилазы Метилирование de novo вносит элементы изменчивости в профиль метилирования Поддерживающее метилирование обеспечивает поддержание уже сформированного профиля Поддерживающее метилирование активируется при каждом клеточном делении

Метилирование ДНК: основные функции Поддержание структуры хроматина и стабильности хромосом Сайленсинг повторенных и интегрированных чужеродных последовательностей Механизм защиты против эффектов встраивания чужеродной ДНК высоко метилированы: Сателлиты и другие повторяющиеся последовательности Транспозоны, провирусные копии Последовательности, характерные для гетерохроматина Тканеспецифичное ненаследуемое долговременное подавление экспрессии генов на уровне транскрипции Формирование профиля экспрессии, характерного для данного типа клеток высоко метилированы: Транскрипционно неактивные гены (в гаметах – все, кроме экспрессируемых гаметоспецифично) Гены “опухолевой инвазии” и другие онкогены Импринтированные гены гипометилированы: транскрипционно активные гены непосредственное влияние метилирования на уровень экспрессии гена далеко не всегда понятно

Волны деметилирования в раннем эмбриогенезе После оплодотворения отцовский геном активно деметилируется, в то время как материнский геном пассивно деметилируется. На стадии имплантации эмбриона паттерны метилирования восстанавливаюся de novo для обоих родительских геномов. После установления специфические паттерны метилирования поддерживаются в поколениях клеток, обеспечивая специфичность экспрессии генов Таким образом, при смене поколений происходит последовательное цикличное метилирование/деметилирование по множеству позиций в геноме

Деметилирование ДНК глобальный характер млекопитающие – ранние этапы развития зародыша, старение cпецифический геномный импринтинг ДНК-деметилаза до сих пор не выявлена

Биологические функции метилированной ДНК геномный импринтинг инактивация Х-хромосомы регуляция структуры хроматина регуляция генной экспрессии репликация ДНК канцерогенез клеточная дифференцировка выключение трансгенов (“silencing”)

Метилирование при раке Опухолевые процессы гиперметилирования характеризуются ключевых инактивацией генов-супрессоров и посредством гипометилирования активацией целого ряда онкогенов (raf, c-fos, c-myc, c-Haras, c-K-ras), факторов роста (IGF 2, TGF) и мобильных повторяющихся элементов, расположенных в районах гетерохроматина.

В геноме присутствуют Участки, свободные от нуклеосом Активные для транскрипции, сайты связывания транскрипционных факторов, регуляторных белков Участки, где положение нуклеосомы строго фиксировано +1 нуклеосома в генах (дрожжи – от +1 нуклеотида, позвоночные – от +60) Участки, в которых нуклеосомная укладка подвержена регуляции белками АТФ-зависимого ремоделинга хроматина

Пост-трансляционные модификации гистонов регуляторных N-концов Ацетилирование лизин (K) Метилирование лизин (K) аргинин(R) Фосфорилирование серин(S) треонин(T) Убиквитинилирование лизин (К) ADP-рибозилирование Сумоилирование

Роль пост-трансляционных модификаций гистонов Изменение электростатического взаимодействия между гистонами и ДНК: Поли. АДФрибозилирование приводит к тому, что гистоны или негистоновые белки приобретают большой отрицательный заряд и отваливаются от ДНК Ацетилирование гистонов также вносит отрицательный заряд, ослабляя взаимодействие ДНК-нуклеосома

Принцип работы “гистонового кода” Аминокислотный остаток в гистоне Модифицирующий фермент Белок, который “воспринимает” модификацию

Наследование гистонового кода Во время репликации нуклеосомы разбираются на димеры и удаляются с ДНК, а затем собираются на ДНК вновь. Для двух дочерних цепей требуется в два раза больше нуклеосом. Часть нуклеосомы во время репликации собирается по полуконсервативному принципу (например, если один димер H 3 H 4 «старый» , то второй – вновь синтезированный). Вновь синтезированные гистоны будут модифицироваться по образцу «старых» .

Изменения Генетические Как правило необратимые (мутации) Изменения первичной структуры ДНК Стабильно наследуемые Эпигенетические Как правило обратимые Не затрагивают изменений первичной структуры ДНК Бывают долговременные и кратковременные Множество взаимосвязанных механизмов Могут возникать как случайно, так и специфическим образом в ответ на определенные изменения среды Эпимутация Предполагается, что эпимутации возникают в 100 раз чаще, чем генетические мутации

Эпимутация Тот же самый ген но различная скрученность хвоста PLo. S Biol 1: 3 (2003)

Первое «полногеномное» исследование эпигенома человеческих клеток Расшифрован эпигеном эмбриональных стволовых клеток человека и клеток соединительной ткани легких (фибробластов). Эпигеном – совокупность состояний метилирования генома и модификаций гистонов

Исследование эпигенома Исследование 80 пар однояйцевых близнецов в возрасте 3 -74 года Чем старше исследуемая пара, тем больше разница в их профилях метилирования и ацетилирования гистонов, что приводило в существенной разнице в паттерне экспрессии генов

Эпигенетика и клонирование При клонировании трехцветной кошки никогда не получится кошка идентичного окраса, так как рисунок определяется случайной пятнистостью и случайной инактивацией одного из аллелей гена, определяющего окраску (черный/коричневый), в Х-хромосоме Имя кошки Сиси (“cc”) от слова “copycat”…

Эпигенетика и канцерогенез В опухолевых клетках паттерн эпигенетических модификаций значительно отличен от такового в нормальных клетках

Эпигенетика и старение Чем длиннее характерная продолжительность жизни у вида животного, тем медленнее снижается у этого вида уровень метилирования с возрастом Формирование аберрантных паттернов метилирования: гипометилирование в стареющих клетках и тканях (в целом) но: гиперметилирование Cp. G-островков в стареющих клетках и тканях Такие же разнонаправленные изменения метилирования характерны для раковых клеток 88 сайтов около 80 генов для которых степень метилирования высоко коррелировала с возрастом

Эпигенетика и старение Интересный факт: Рабочая пчела живет 6 недель, а пчеломатка – 6 лет. Генетически они идентичны. Различаются только тем, что будущую пчеломатку во время развития кормят маточным молочком на несколько дней больше, чем обычную рабочую пчелу. В результате у представителей этих пчелиных каст формируются несколько отличные эпигенотипы. И, несмотря на внешнее и биохимическое подобие, длительность их жизни различается в 50 раз!

Уровни эпигенетической регуляции 1. ДНК (геном) 2. РНК (транскриптом) регуляторные мотивы пре-м. РНК, антисмысловые РНК, нетранслирующиеся РНК, микро РНК, двухцепочечные РНК 3. Белки (протеом) метилирование, повторяющиеся последовательности, мутации отдаленных регуляторных элементов, транспозиции генетического материала метилирование/деметилирование лизина 4 и 9 гистона Н 3, ацетилирование/деацетилирование гистонов?

Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов эукариот Посттранскрипционная регуляция включает в себя механизмы контролирующие или регулирующие м. РНК после синтеза. Альтернативный сплайсинг Скорость транспорта м. РНК через ядерную мемрану Время жизни м. РНК РНК-РНК взаимодействия

Время жизни РНК Анализ альтерантивных изоформ генов дрожжей показал среди них высокую гетерогенность времени жизни. Было найдено 560 стабилизирующих м. РНК элементов и 851 дестабилизирующих Одним из таких элементов, широко встречающимся среди м. РНК оказалась poly. U последовательность недалеко от 3’ конца, приводящая к образованию вторичной структуры с poly. A хвостом. Global Analysis of m. RNA Isoform Half-Lives Reveals Stabilizing and Destabilizing Elements in Yeast. Joseph V. Geisberg, Zarmik Moqtaderi, Xiaochun Fan, Fatih Ozsolak and Kevin Struhl. Cell, Volume 156, Issue 4, 812 -824, 13 February 2014

Новый класс ce. RNA Если одна mi. RNA может регулировать экспрессию сотен РНК, то экспрессия этих РНК оказывается связанной ce. RNA – competitive endogenous RNA – конкурентные эндогенные РНК

RNA-mediated gene activation Авторами было впервые показано, что при использовании si. RNA комплементарной промоторному участку приводит к увеличению экспрессии гена в несколько раз В то же время только использование неполностью комплементарной si. RNA (MM – mismatched) не имела такого действия Также было показано, что сей процесс происходит при участии белка Ago 2 Involvement of argonaute proteins in gene silencing and activation by RNAs complementary to a non-coding transcript at the progesterone receptor promoter. Yongjun Chu, Xuan Yue, Scott T. Younger, Bethany A. Janowski and David R. Corey. Nucl. Acids Res. (2010) 38 (21): 7736 -7748.

RNA-mediated gene activation Не только с помощью si. RNA, но и посредством mi. RNA В другом исследовании было показано что mi. R-205 транскрипционно активирует гены супрессоры опухолевого роста IL-24 и IL-32, через комплементарные последовательности в их промоторах, что приводит к увеличению экспрессии как на уровне м. РНК так и на уровне белка. Micro. RNA-205 -directed transcriptional activation of tumor suppressor genes in prostate cancer. Majid S, Dar AA, Saini S, Yamamura S, Hirata H, Tanaka Y, Deng G, Dahiya R. Cancer 2010; 116: 5637 -49;

Природные антисмысловые транскрипты Парой смысловой-антисмысловой транскрипты называется пара чьи последовательности м. РНК комплементарны. Цис-антисмысловой транскрипт экспрессируется в одном геномном локусе со смысловым транскриптом. Транс-антисмысловой транскрипт экспрессируется с другого геномного локуса чем смысловой транскрипт. цис-ПАТ транс-ПАТ

Перекрывающиеся природные антисмысловые транскрипты Сходящиеся (конец к концу) Расходящиеся (голова к голове) Неперекрывающиеся природные антисмысловые транскрипты Более 70% цис-ПАТ имеют сходящийся тип (перекрывание 3’ концов), в то время как только 15% имеют расходящийся тип. Оставшиеся 15% принадлежат ПАТ с полным перекрыванием или с отсутствием такового (интронные). Ориентация ПАТ конец к концу является в 5 раз более эволюционно консерватиной.

Встречаемость цис-ПАТ в нескольких эукариотических организмах Виды Перекрывающиеся транскрипты Всего транскриптов Доля (%) Human 5, 880 26, 741 22 Mouse 12, 519 43, 553 29 Rat 548 11, 332 5 Chicken 356 7, 390 5 Drosophila 2, 054 13, 379 15 Rice 1, 374 20, 477 7 Arabidopsis 2, 680 29, 993 9 Nematode 76 14, 406 0. 5 Yeast 610 7, 598 8

Природные антисмысловые транскрипты смысловой – sense условное деление антисмысловой - antisense Фактически мы имеем РНК-РНК взаимодействие, которое может иметь функциональное значение, а может и не иметь его.

Транскрипционная интерференция РНК маскирование Двух-цепочечное РНК-зависимое замалчивание Моделирование хроматина Негативная регуляция Механизмы регуляции экспрессии генов с помощью ПАТов

Позитивная регуляция антисмысловыми транскриптами Антисмысловой транскрипт к гену Zeb 2 маскирует сайт сплайсинга и приводит к удержанию интрона в пре-м. РНК смыслового гена, что изменяет характер инициации трансляции и сопровождается значительной ее активацией. Стабилизация или активация экспрессии смыслового транскрипта p 53 с помощью антисмысловой РНК Wrap 53. Показано что in vivo формирование дуплекса между смысловым и антисмысловым транскриптами в области 5′-нетранслируемой области м. РНК TP 53, что вызывает как транскрипционную, так и трансляционную активацию экспрессии смыслового гена p 53. Нокдаун Wrap 53 ведет к значительному снижению уровня смысловой м. РНК и супрессии активации белка p 53 при повреждении ДНК. И наоборот, при гиперэкспрессии Wrap 53 повышается уровень м. РНК смыслового гена, и клетки становятся более чувствительны к p 53 -опосредованному апоптозу.

Src="https://present5.com/presentation/79093091_357628544/image-85.jpg" alt="Изучение принципов регуляции антисмысловыми транскриптами Антисмысловая регуляция Негативная Позитивная AS ═> S↓ AS ═>"> Изучение принципов регуляции антисмысловыми транскриптами Антисмысловая регуляция Негативная Позитивная AS ═> S↓ AS ═> S Отсутствие

Некодирующая TINCR РНК При исследовании транскриптома клеток предшественников и дифференцированных кератиноцитов была найдена linc. RNA меняющая экспрессию в 150 раз. TINCR находится на 19 хромосоме, состоит из 3 экзонов общей длинной 3, 7 Кб. Для РНК TINCR были сделаны эксперименты по pull-down и найдено 1814 взаимодействующих РНК и белок STAU 1, известный как РНК-связывающий белок. Также был проведён нокдаун TINCR и найдено 419 генов изменивших экспрессию более чем в 2 раза. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Kretz M, Siprashvili Z, Chu C, Webster DE, Zehnder A, Qu K, Lee CS, Flockhart RJ, Groff AF, Chow J, Johnston D, Kim GE, Spitale RC, Flynn RA, Zheng GX, Aiyer S, Raj A, Rinn JL, Chang HY, Khavari PA. Nature. 2013 Jan 10; 493(7431): 231 -5.

Некодирующая TINCR РНК Таким образом, был выявлен первый РНК-интерактом для РНК TINCR Интересно, что пересечение между РНК выловленными (1814) и РНК изменившими экспрессию при нокдауне TINCR (419), составили 56 генов. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Kretz M, Siprashvili Z, Chu C, Webster DE, Zehnder A, Qu K, Lee CS, Flockhart RJ, Groff AF, Chow J, Johnston D, Kim GE, Spitale RC, Flynn RA, Zheng GX, Aiyer S, Raj A, Rinn JL, Chang HY, Khavari PA. Nature. 2013 Jan 10; 493(7431): 231 -5.

Некодирующая p 21 РНК При поиске генов изменяющих экспрессию при различных условиях индукции p 53 у мыши было найдено около 40 linc. RNA Одна из них p 21 – содержала 2 экзона длинной 3. 1 Kb. Экспериментами pull-down был найден белокрепрессор hn. RNP-K связывающийся с р21 Путем делеционного анализа был найден участок в 780 нуклеотидов в 5’-конца необходимый для связывания с hn. RNP-K. 280 нуклеотидов в нём обладают высокой консервативность и формируют стабильную вторичную структуру. Серией экспериментов показано что p 21 взаимодействуя с hn. RNP-K подавляет экспрессию около 1, 5 тысячи генов, с промоторами которых способен связываться с hn. RNP-K A large intergenic noncoding RNA induced by p 53 mediates global gene repression in the p 53 response. Huarte M, Guttman M, Feldser D, Garber M, Koziol MJ, Kenzelmann-Broz D, Khalil AM, Zuk O, Amit I, Rabani M, Attardi LD, Regev A, Lander ES, Jacks T, Rinn JL. Cell. 2010 Aug 6; 142(3): 409 -19.

Некодирующая p 21 РНК На клетках He. La было показано что linc-p 21 взаимодействует с Hu. R, увеличивая скорость её деградации. Hu. R является широко-экспрессирующимся РНКсвязывающим белком, способным влиять на клеточную пролиферацию, выживание, канцерогенез, стресс и иммунный ответ. Эксперименты по pull-down показали что с p 21 взаимодействует также белок Ago 2, который также участвует с Hu. R в деградации p 21. Зная, что Hu. R участвует в репрессии b-катенина (CTNNB 1) и Jun. B (JUNB), авторы решили проверить участие в этом р21. Биоинформатический анализ показал, что р21 имеет с b-катенином 15 комплементарных участков а Jun. B – 8, размером от 15 до 33 нуклеотидов, что подтвердили эксперименты по pull-down. Эксперименты по pull-down выявили два трансляционных репрессора - Rck и FMRP. В дальнейшем для Rck было показано, что в присутствии p 21 белок Rck ингибирует трансляцию b-катенина и Jun. B. Linc. RNA-p 21 suppresses target m. RNA translation. Yoon JH, Abdelmohsen K, Srikantan S, Yang X, Martindale JL, De S, Huarte M, Zhan M, Becker KG, Gorospe M. Mol Cell. 2012 Aug 24; 47(4): 648 -55.

Некодирующая p 21 РНК Linc. RNA-p 21 suppresses target m. RNA translation. Yoon JH, Abdelmohsen K, Srikantan S, Yang X, Martindale JL, De S, Huarte M, Zhan M, Becker KG, Gorospe M. Mol Cell. 2012 Aug 24; 47(4): 648 -55.

Трансляционная регуляция экспрессии генов эукариот Трансляционная регуляция включает в себя механизмы предотвращающие синтез белка. Как правило, очень часто речь идет о белковых факторах необходимых для трансляции Предотвращение рибосом от связывания с м. РНК Факторы инициации трансляции

Посттрансляционная регуляция экспрессии генов эукариот Посттрансляционная регуляция включает в себя механизмы действующие на белок после его синтеза. Активация белков Некоторые белки не активны после синтеза, они должны пройти пострансляционнии модификации Много белков активируются после фосфорилирования Feedback Control Некоторые ферменты в метаболических путях могут быть негативно ингибированы продуктами этого же пути Деградация белков

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цель и задачи исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Научно-практическая значимость работы

1.5. Обоснование постановки темы диссертационной работы

2. Обзор литературы

2.1. Принципы регуляции экспрессии генов у эукариот.

Основные элементы

2.1.1. Промоторы

2.1.2. Энхансеры

2.1.3. Транскрипционные факторы

2.1.4. Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК

2.2. Сравнение регуляторных частей у гомологичных генов

3. Материалы и методы

3.1. Материалы и оборудование

3.2. Методы

4. Результаты и обсуждение

4.1. Определение нуклеотидной последовательности промоторной области гена человека RFP

4.2. Компьютерный анализ промоторной области гена человека RFP2.

4.3. Функциональная характеристика промоторного региона гена человека RFP

4.4. Потенциальные регуляторные элементы промоторной области гена человека RFP

4.5. Установление структуры гена мыши Rfp

4.6. Сравнительный анализ области гена RFP2 у человека и

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и особенности регуляции генов гомологов RFP2 у человека и мыши»

1.1. Актуальность проблемы. Опухолевые заболевания являются одной из ведущих по частоте групп болезней человека и одной из основных причин смертности взрослого населения. Вероятность возникновения и интенсивность прогрессии опухолей зависят от генотипа индивида и от соматических мутаций, возникающих в процессе индивидуального развития. Важным генетическим барьером на пути возникновения и прогрессии опухолей являются гены-супрессоры опухолей. Мутации в этих генах «запускают» опухолевый процесс и этапы его прогрессии. Изучение тонкой структуры и регуляции генов супрессоров у человека необходимы для понимания генетического контроля нормы, определяемой этими генами, и молекулярно-генетических механизмов возникновения и прогрессии опухолей. Поэтому проведение таких исследований является высоко актуальным. Такие исследования стали возможны в последние годы в результате реализации всемирной и российской программ геном человека. Исследование тонкой структуры и функционирование отдельных областей генома проводят сегодня путем сопоставления данных о структуре генома человека в норме с данными о его структуре при патологическом опухолевом процессе, а также на основе данных сравнительной геномики. Такой подход стал возможным лишь в самое последнее время, и бвл использован в ходе осуществления данной диссертационной работы. 1.2. Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение структурнофункциональных особенностей регуляторного района гена RFP2 человека, как наиболее вероятного гена супрессора опухолевого роста, расположенного в области ql4 хромосомы 13. Для реализации поставленной цели решались следующие задачи: 1. Определить этого гена. 2. Провести биоинформатический анализ промоторной области и выявить потенциальные элементы регуляции транскрипции гена RFP2 3. Выявить и провести анализ спектра потенциальных и список сайтов самих связывания транскрипционных факторов нуклеотидную последовательность промоторного региона гена RFP2 человека и точку инициации транскрипции для транскрипционных факторов, взаимодействующих с регуляторной областью гена RFP2 у человека 4. Минимизировать промоторную область гена RFP2 человека и экспериментально элементы этого гена. 5. Определить региона гена сравнительный нуклеотидную RFP2 мыши анализ последовательность и провести последовательностей промоторного нуклеотидов биоинформатический локализовать потенциальные регуляторные промоторных районов гена RFP2 человека и мыши и, таким образом, выявить причины сходства спектров тканеспецифичности экспрессии гена RFP2 у человека и мыши. 1.3. Научная новизна. Впервые определена и зарегистрирована в GenBank (AF363782) последовательность промоторный нуклеотидов гена длиной 3,6 RFP2. т.п.н содержащая регион человека Экспериментально определено положение точки инициации транскрипции гена RFP2. Впервые проведен компьютерный анализ промоторной области гена RFP2 человека и вьывлены потенциальные элементы регуляции этого гена: GC-бокс и сайты связывания транскрипционных факторов. Выявлена уникальная особенность структуры промотора гена RFP2: в транскрибируемой асимметрия в нити ДНК перед ОС-боксом сайтов расположен связывания несовершенный повтор структуры GnA длиной 280 п.н. Выявлена распределении количества транскрипционных факторов в области несовершенного повтора: около 200 сайтов находятся в транскрибируемой нити ДНК, а в нити, комплементарной этому участку, сайты связывания отсутствуют. Впервые с помощью люциферазных конструкций локализованы четыре регуляторных элемента промотора гена RFP2: базальный промотор, энхансер, сайленсер и участок, отвечающий за стабильность мРНК гена RFP2. Определены потенциальные сайты промотора связывания гена RFP2, транскрипционных факторов в участках предположительно содержащих энхансер и сайленсер. Проведен сравнительный компьютерный анализ последовательности нуклеотидов промоторной области гена RFP2 человека и мыши. Обнаружен разрыв синтении хромосом человека и мыши непосредственно перед белоккодирующей областью гена, которая остается гомологичной у человека и мыши. Экспериментально выявлены две изоформы гена мыши ортологичного гену RFP2 человека. Впервые с помощью биоинформатического анализа в регуляторной части гена RFP2 у мыши выявлен набор 20 потенциальных сайтов связывания для 18 факторов транскрипции, относящимися к 11 семействам. Проведен сравнительный анализ наборов сайтов связывания транскрипционных факторов и самих транскрипционных факторов в регуляторной области генов RFP2 у мыши и человека.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Скоблов, Михаил Юрьевич

1. Определена и зарегистрирована в GenBank (AF363782) последовательность нуклеотидов длиной 3,6 т.п.н содержащая промоторный региона и участок инициации транскрипции гена RFP2 человека. Положение точки инициации транскрипции гена RFP2 определено экспериментально.

2. Проведен компьютерный анализ промоторной области гена RFP2 человека и выявлены потенциальные элементы регуляции этого гена: GC-бокс и сайты связывания транскрипционных факторов. Проведенный анализ выявил порядка 300 потенциальных сайтов связывания, для 26 факторов транскрипции, относящимися к 17 семействам.

3. Выявлена уникальная особенность структуры промотора гена RFP2 человека: в транскрибируемой цепи ДНК перед GC-боксом расположен несовершенный повтор структуры GnA длиной 280 п.н. Выявлена асимметрия в распределении количества сайтов связывания транскрипционных факторов в области несовершенного повтора: около 200 сайтов находятся в транскрибируемой цепи ДНК, а в цепи, комплементарной этому участку, сайты связывания отсутствуют.

4. Получены 9 делеционных производных промоторного участка гена RFP2 человека в составе рекомбинантных плазмид с репортерным геном люциферазы. Экспериментально определена активность промотора каждого делеционного варианта и локализованы четыре регуляторных элемента промотора гена RFP2: базальный промотор, энхансер, сайленсер и участок, отвечающий за стабильность РНК гена RFP2.

5. Определены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов в участках промотора гена RFP2 человека, предположительно содержащих энхансер и сайленсер.

6. Экспериментально выявлены две изоформы гена мыши ортологичного гену RFP2 человека определив тем самым возможные промоторные регионы. Проведен сравнительный компьютерный анализ последовательности нуклеотидов промоторной области гена RFP2 человека установленной в нашей работе и опубликованной в ходе нашей работы последовательности нуклеотидов промоторной области гена Rfp2 мыши. Обнаружен разрыв синтении хромосом человека и мыши непосредственно перед белок-кодирующей областью гена, которая остается гомологичной у человека и мыши.

7. Проведен биоинформатический анализ регуляторной части гена Rfp2 у мыши. Проведен сравнительный анализ регуляторных элементов выявленных в промоторных областях генов RFP2 у мыши и человека. Проанализированые регуляторные элементы транскрипции не имеют общих черт для объяснения сходства спектров тканеспецифичности экспрессии гена RFP2 у человека и мыши.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Скоблов, Михаил Юрьевич, 2004 год

1. Патрушев Л.И., Экспрессия генов., Москва, 2000.

2. Abbott A., Abu-Threideh J., Ahrens С., et al. Genome Sequence of the Nematode Caenorhabditis elegans. A Platform for Investigating Biology // Science. 1998. V. 282. P. 2012-2018.

3. Adams MD, Celniker SE, Holt RA., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster// Science. 2000. V. 287. P. 2185-95.

4. Aravin AA., Naumova NM, Tulin AV, Vagin VV, Rozovsky YM, Gvozdev VA. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline.// Curr. Biol. 2001. V. 11, P. 1017-1027.

5. Banerji J., Olson L., Schaffher W. A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy chain genes // Cell. 1983. V. 33, P. 729-740.

6. Baranova AV, Lobashev AV, Ivanov DV, Krukovskaya LL, Yankovsky NK, Kozlov AP. In silico screening for tumour-specific expressed sequences in human genome. // FEBS Lett. 2001. V. 508 P. 143-8.

7. Bass BL. RNA editing by adenosine deaminases that act on RNA. //Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71, P. 817-846.

8. Baylin SB, Herman JG. Epigenetics and loss of gene function in cancer. In DNA Alterations in Cancer (Ehrlich, M., ed.). Eaton publishing, MA, USA. 2000. P. 293-309.

9. Blackwood EM, Kadonaga JT. Going the Distance: A Current View of Enhancer Action. // Science., 1998., V. 281. P.60.

10. Blackwood MA, Weber BL. BRCA1 and BRCA2: from molecular genetics to clinical medicine. //J Clin Oncol. 1998. V. 16. P. 1969-77.

11. Burke LJ, Zhang R, Lutz M, Renkawitz R. The thyroid hormone receptor and the insulator protein CTCF: two different factors with overlapping functions. // J Steroid Biochem Mol Biol. 2002. V. 83. P. 49-57.

12. Castresana J. Genes on human chromosome 19 show extreme divergence from the mouse orthologs and a high GC content // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P.1751 1757.

13. Chinwalla AT, Cook LL, Delehaunty KD, et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome // Nature. 2002. V. 420. P. 520-562.

14. Ehrlich M. DNA hypomethylation and cancer. // In: DNA Alterations in Cancer. (Ehrlich, M., ed.). Eaton Publishing, MA, USA. 2000. P. 273-291.

15. Emes RD, Goodstadt L, Winter EE, Ponting CP. Comparison of the genomes of human and mouse lays the foundation of genome zoology. // Hum Mol Genet. 2003 Apr 1; 12(7): 701-9.

16. Feng Q., Zhang Y., Hao P., et al. Sequence and analysis of rice chromosome 4// Nature. 2002. V. 420. P. 316-20.

17. Gibbs RA, Weinstock GM, Metzker ML, Muzny DM, Sodergren EJ, Scherer S, Scott G. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution. //Nature. 2004. V. 428. P. 493-521.

18. Gilles SD, Tonegawa S., Expression of cloned immunoglobulin genes introduced into mouse L cells. // Nucleic Acids Res. 1983. V. 11. P. 7981-97.

19. Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H., et al. Life with 6000 genes // Science. 1996. V. 274. P. 563-7.

20. Gray M.D., Shen J.C., Kamath-Loel A.S. et al. The Werner syndrome protein is a DNA helicase. // Nature Genet. 1997. V. 17. P. 100103.

21. Grosschedl R, Birnstiel M. Spacer DNA sequences upstream of the TATA sequence are essential for promotion of H2a gene transcription in vivo. // Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 1980. V. 77, P. 7102 7106.

22. Ham J, Steger G, Yaniv M., How do eukaryotic activator proteins stimulate the rate of transcription by RNA polymerase II? // FEBS Lett. 1992. V. 307. P. 81-6.

23. Hannon, G.J. RNA interference. // Nature. 2002. V. 418, 244-251

24. Holt RA., Subramanian GM, Halpern A, et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae // Science. 2002. V. 298. P. 129-49.

25. Kennerdell JR, Yamaguchi S, Carthew RW. RNAi is activated during Drosophila oocyte maturation in a manner dependent on aubergine and spindle-E. //Genes Dev. 2002 V. 16, P. 1884-1889.

26. Kim J, Iyer VR., Global role of TATA box-binding protein recruitment to promoters in mediating gene expression profiles. // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. P. 8104-12.

27. Kiyosawa H, Yamanaka I, Osato N, Kondo S, Hayashizaki Y; RIKEN GER Group; GSL Members. .Antisense transcripts with FANTOM2 clone set and their implications for gene regulation. // Genome Res. 2002. V. 13, P. 1324-1334.

28. Koop B.F., Hood L. Striking sequence similarity over almost 100 kilobases of human and mouse T-cell receptor DNA // Nat Genet. 1994. V. 7. P. 48-53.

29. Kumar M. and Carmichael GG. Nuclear antisense RNA induces extensive adenosine modifications and nuclear retention of target transcripts. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94, P. 3542-3547.

30. Kuo S, Chesrown SE, Mellott JK, Rogers RJ, Hsu JL, Nick HS. In vivo architecture of the manganese superoxide dismutase promoter. II J Biol Chem. 1999. V. 274 P.3345-54.

31. Lamerdin JE, Montgomery MA, Stilwagen S.A., Scheidecker LK, Tebbs RS, Brookman KW, Thompson LH, Carrano AV. Genomic sequence comparison of the human and mouse XRCC1 DNA repair gene regions. // Genomics. 1995. V. 25. P. 547-54.

32. Lander E.S., Linton L.M., Birren В., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. 2001. V. 409. P. 860-921.

33. Lavorgna G., Dahary D, Lehner B, Sorek R, Sanderson C.M., Casari G. In search of antisense. // Trends in Biochemical Sciences 2004. V.29.P. 15-21.

34. Lehner, B. et al. Antisense transcripts in the human genome. //Trends Genet. 2002. V. 18, P. 63-65.

35. Lieberman PM, Berk AJ. A mechanism for TAFs in transcriptional activation: activation domain enhancement of TFIID-TFIIA--promoter DNA complex formation. // Genes Dev. 1994 V.8. P.995-1006.

36. Magoulas C, Fried M. Isolation and genomic analysis of the human surf-6 gene: a member of the Surfeit locus // Gene. 2000. Vol. 8. P. 115-23.

37. Munroe, SH, Lazar MA. Inhibition of c-erbA mRNA splicing by a naturally occurring antisense RNA. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 2208322086.

38. Nordhoff V., Hubner K., Bauer A., et al. Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences // Mamm Genome. 2001. Vol. 12. P. 309-17.

39. Oeltjen J., Malley Т., Muzny D., et al. Large-scale comparative sequence analysis of the human and murine bruton"s tyrosine kinase loci reveals conserved regulatory domains // Genome Research. 1997. V. 7. P. 315-329.

40. Okazaki Y., M. Furuno, T. Kasukawa, J. Adachi, H. Bono, S. Kondo, et al., Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. // Nature., 2002 V. 420, P. 563-73.

41. Pedersen AG, Baldi P, Chauvin Y, Brunak S., The biology of eukaryotic promoter prediction-a review. // Comput Chem. 1999. V. 23. P. 191-207.

42. Peters, NT, Rohrbach JA, Zalewski BA, Byrkett CM, Vaughn JC. RNA editing and regulation of Drosophila 4frnp expression by sas-10 antisense readthrough mRNA transcripts. // RNA. 2002. V. 9. P. 698-710.

43. Prescott EM. Proudfoot NJ. Transcriptional collision between convergent genes in budding yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. V. 99. P. 8796-8801.

44. Ptashne M. How eukaryotic transcriptional activators work. II Nature. 1988. V.335. P. 683-9.

45. Ptashne M, Gann AA. Activators and targets. //Nature. 1990. V. 346. P. 329-31.

46. Queen C, Baltimore D. Immunoglobulin gene transcription is activated by downstream sequence elements. //Cell. 1983. V. 33. P. 741-8.

47. Reik W, Walter, J. Genomic imprinting: parental influence on the genome. // Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. P. 21-32.

48. Risitano A, Fox KR. Stability of intramolecular DNA quadruplexes: comparison with DNA duplexes. // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 6507-13.

49. Runte M, Huttenhofer A, Gross S, Kiefmann M, Horsthemke B, Buiting K. The IC-SNURF-SNRPN transcript serves as a host for multiple small nucleolar RNA species and as an antisense RNA for UBE3A. // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 2687-2700.

50. Salanoubat M., Lemcke K., Rieger M., et al. Sequence and analysis of chromosome 3 of the plant Arabidopsis thaliana. // Nature. 2000. V. 408. P. 820-2.

51. Sanchez M., Queralt R., Bruguera M., Rodes J., Oliva R. Cloning, sequencing and characterization of the rat hereditary hemochromatosis promoter: comparison of the human, mouse and rat HFE promoter regions // Gene. 1998. Vol. 225. P. 77-87.

52. Sasaki Т., Matsumoto Т., Yamamoto K., et al. The genome sequence and structure of rice chromosome 1 // Nature. 2002. V. 420. P. 3126.

53. Scadden AD, Smith CW. Specific cleavage of hyper-edited dsRNAs. // EMBO J. 2001. V. 20. P. 4243-4252.

54. Schild-Poulter C, Shih A, Yarymowich NC, Hache RJ. Down-regulation of histone H2B by DNA-dependent protein kinase in response to DNA damage through modulation of octamer transcription factor 1. // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 7197-205.

55. Schramke V, Allshire, R. Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs affect RNAi and chromatin-based gene silencing. // Science. 2003. V. 301. P. 1069-1074.

56. Shendure J, Church G.M. Computational discovery of sense-antisense transcription in the human and mouse genomes. // Genome Biol. 2002, V.3. P.l-14.

57. Shenk T. Transcriptional control regions: nucleotide sequence requirements for initiation by RNA polymerase II and Ш. // Curr Top Microbiol Immunol. 1981. V. 93 P. 25-46.

58. Sorek R, Safer, HM. A novel algorithm for computational identification of contaminated EST libraries. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 1067-1074.

59. Stamm S, Zhu J, Nakai K, Stoilov P, Stoss O, Zhang M. An alternative-exon database and its statistical analysis. // DNA Cell Biol. 2002. V. 19. P. 739-756.

60. Suzuki Y, Yamashita R, Shirota M, Sakakibara Y, Chiba J, Mizushima-Sugano J, Nakai K, Sugano S. Sequence comparison of human and mouse genes reveals a homologous block structure in the promoter regions. // Genome Res. 2004. V. 14. P. 1711-8.

61. Tabata S., Kaneko Т., Nakamura Y., et al. Sequence and analysis of chromosome 5 of the plant Arabidopsis thaliana. // Nature. 2000. V. 408. P. 823-6.

62. The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana // Nature. 2000. V. 408. P. 796-815.

63. Theologis A, Ecker JR, Palm CJ et al. Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana // Nature. 2000. V.408. P. 816-20.

64. Tufarelli C., Stanley JA, Garrick D, Shaipe JA, Ayyub H, Wood WG, Higgs DR. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. // Nat. Genet. 2003. V. 34. P. 157-165.

65. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W., et. al. The sequence of the human genome // Science. 2001. V. 291. P. 1304-1351.

66. Volpe ТА, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SI, Martienssen RA. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science. 2002. V. 297 P. 1833-1837.

67. Weaks RL, Ramsoondar JJ, Gallagher DS Jr, Nogues C, Piedrahita JA. Isolation, characterization and chromosomal localization of the porcineciliary neurotrophic factor (CNTF) gene 11 Anim Genet. 1997. Vol. 28. P. 354-7.

68. Westman В J, Mackay JP, Gell D. Ikaros: a key regulator of haematopoiesis. // Int J Biochem Cell Biol. 2002. V. 34. P. 1304-7.

69. Wingender E, Dietze P, Karas H, Knuppel R. TRANSFAC: a database on transcription factors and their DNA binding sites. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 238-41.

70. Wutz A. Barlow DP. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island. // Mol Cell Endocrinol. 1998. V.140, 914.

71. Zhang Z, Carmichael GG. The fate of dsRNA in the in the human genome. // Nat. Biotechnol. 2001. V. 21. P. 379-386.

72. Zhu H, Joliot V, Prywes R., Role of transcription factor TFIIF in serum response factor-activated transcription // J Biol Chem. 1994. V. 269. P.3489-97.

74. Иванов Д.В., Бородина Т.А., Скоблов М.Ю., Пестова А.А., Капанадзе Б.И., Сангфельдт У., Эйнхорн С., Баранова А.В., Янковский Н.К.

75. Структурное и функциональное исследование нового гена человека RFP2. Постерное сообщение на 10-й итоговой конф. "Геном Человека-2000", г.Черноголовка, 18-22 декабря 2000 г.

76. M.Yu. Skoblov, D.V. Ivanov, K.S.Shachbasov, A.V.Baranova, N.K.Yankovsky Promoter region structure of human gene RFP2 Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology International symposium, 2001, Novemberl 8-24, Moscow-Minsk

77. Я благодарю всех людей, которые помогли мне выполнить эту работу, а также тех, кто мне в этом не мешал:

78. Николая Казимировича Янковского за научное и административное руководство, и существование замечательной лаборатории анализа генома.

79. Анчу Баранову за то, что благодаря ей сложилось моё научное мировоззрение, и я ощутил свободу научной деятельности. Спасибо за все, за эту маленькую жизнь, которую мы прожили.

80. Аню Гуськову и Костю Шахбазова идти вперед, в неизвестность, тяжелее всего. Спасибо, что вы были со мной.

81. Спасибо Андрею Лобашеву за его общение, воспоминание о котором мне очень приятны.

82. Всех сотрудников, аспирантов и студентов лаборатории анализа генома, бывших и нынешних, за приятную человеческую атмосферу.

83. Моих родителей, за их постоянную поддержку и понимание.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Введение

1. Введение 4

1.1. Актуальность проблемы 4

1.2. Цель и задачи исследования 4

1.3. Научная новизна 5

1.4. Научно-практическая значимость работы 6

1.5. Обоснование постановки темы диссертационной работы 7

2. Обзор литературы 9

2.1. Принципы регуляции экспрессии генов у эукариот Основные элементы 9

2.1.1. Промоторы 9

2.1.2. Энхансеры 20

2.1.3. Транскрипционные факторы 25

2.1.4. Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК

2.2. Сравнение регуляторных частей у гомологичных генов 45

3. Материалы и методы 51

3.1. Материалы и оборудование 51

3.2. Методы 53

4. Результаты и обсуждение 66

4.1. Определение нуклеотидной последовательности промоторной области гена человека RFP2

4.2. Компьютерный анализ промоторной области гена человека RFP2.

4.3. Функциональная характеристика промоторного региона гена человека RFP2

4.4. Потенциальные регуляторные элементы промоторной области гена человека RFP2

4.5. Установление структуры гена мыши Щр2 85

4.6. Сравнительный анализ области гена RFP2 у человека и мыши 88

Общее заключение 90

Список цитируемой литературы. 93

Введение к работе

1.1. Актуальность проблемы.

Опухолевые заболевания являются одной из ведущих по частоте групп болезней человека и одной из основных причин смертности взрослого населения. Вероятность возникновения и интенсивность прогрессии опухолей зависят от генотипа индивида и от соматических мутаций, возникающих в процессе индивидуального развития. Важным генетическим барьером на пути возникновения и прогрессии опухолей являются гены-супрессоры опухолей. Мутации в этих генах «запускают» опухолевый процесс и этапы его прогрессии. Изучение тонкой структуры и регуляции генов супрессоров у человека необходимы для понимания генетического контроля нормы, определяемой этими генами, и молекулярно-генетических механизмов возникновения и прогрессии опухолей. Поэтому проведение таких исследований является высоко актуальным.

Такие исследования стали возможны в последние годы в результате реализации всемирной и российской программ геном человека. Исследование тонкой структуры и функционирование отдельных областей генома проводят сегодня путем сопоставления данных о структуре генома человека в норме с данными о его структуре при патологическом опухолевом процессе, а также на основе данных сравнительной геномики. Такой подход стал возможным лишь в самое последнее время, и бвл использован в ходе осуществления данной диссертационной работы.

1.2. Цель и задачи исследования.

Целью исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей регуляторного района гена RFP2 человека, как наиболее вероятного гена супрессора опухолевого роста, расположенного в области ql4 хромосомы 13.

Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. Определить нуклеотидную последовательность промоторного региона гена RFP2 человека и точку инициации транскрипции для этого гена.

2. Провести биоинформатический анализ промоторной области и выявить потенциальные элементы регуляции транскрипции гена RFP2

3. Выявить и провести анализ спектра потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов и список самих транскрипционных факторов, взаимодействующих с регуляторной областью гена RFP2 у человека

4. Минимизировать промоторную область гена RFP2 человека и экспериментально локализовать потенциальные регуляторные элементы этого гена.

5. Определить нуклеотидную последовательность промоторного региона гена RFP2 мыши и провести биоинформатический сравнительный анализ последовательностей нуклеотидов промоторных районов гена RFP2 человека и мыши и, таким образом, выявить причины сходства спектров тканеспецифичности экспрессии гена RFP2 у человека и мыши.

1.3. Научная новизна.

Впервые определена и зарегистрирована в GenBank (AF363782) последовательность нуклеотидов длиной 3,6 т.п.н содержащая промоторный регион гена человека RFP2. Экспериментально определено положение точки инициации транскрипции гена RFP2. Впервые проведен компьютерный анализ промоторной области гена RFP2 человека и выявлены потенциальные элементы регуляции этого гена: GC-бокс и сайты связывания транскрипционных факторов. Выявлена уникальная особенность структуры промотора гена RFP2: в транскрибируемой нити ДНК перед GC-боксом расположен несовершенный повтор структуры GnA длиной 280 п.н. Выявлена асимметрия в распределении количества сайтов связывания транскрипционных факторов в области несовершенного повтора: около 200 сайтов находятся в транскрибируемой нити ДНК, а в нити, комплементарной этому участку, сайты связывания отсутствуют. Впервые с помощью люциферазных конструкций локализованы четыре регуляторных элемента промотора гена RFP2: базальный промотор, энхансер, сайленсер и участок, отвечающий за стабильность мРНК гена RFP2. Определены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов в участках промотора гена RFP2, предположительно содержащих энхансер и сайленсер. Проведен сравнительный компьютерный анализ последовательности нуклеотидов промоторной области гена RFP2 человека и мыши. Обнаружен разрыв синтении хромосом человека и мыши непосредственно перед белок-кодирующей областью гена, которая остается гомологичной у человека и мыши. Экспериментально выявлены две изоформы гена мыши ортологичного гену RFP2 человека. Впервые с помощью биоинформатического анализа в регуляторной части гена RFP2 у мыши выявлен набор 20 потенциальных сайтов связывания для 18 факторов транскрипции, относящимися к 11 семействам. Проведен сравнительный анализ наборов сайтов связывания транскрипционных факторов и самих транскрипционных факторов в регуляторной области генов RFP2 у мыши и человека.

1.4. Практическая значимость.

Установление последовательности нуклеотидов промоторной области потенциального гена супрессора опухолей RFP2 практически полезно в качестве основы для мутационного скрининга повреждений этого гена в группах пациентов с опухолевыми заболеваниями, сопровождающимися утратой области генома 13q 14.

1.5. Обоснование постановки темы диссертационной работы.

Тем не менее, именно в этой группе больных утрата области генома 13ql4 является наиболее частой (до 80% в некоторых выборках) .

Одной из возможных мишеней для мутаций, инактивирующих ген, является его регуляторная область. Для проведения мутационного анализа этой области у больных необходимо знание ее структуры и принципов ее регуляции в норме. Структура промоторной области в случае гена RFP2 человека была неизвестна к началу данной работы, хотя первая версия черновой последовательности генома человека к тому времени уже была доступна. Кроме того, структура регуляторнои области гена влияет на тканевый спектр его экспрессии. Поэтому информация о структуре регуляторнои области опухолевых супрессоров, необходима для понимания молекулярных механизмов возникновения и прогрессии опухолей, ассоциированных с утратой области 13ql4, в том числе множественной миеломы и карциномы простаты .

Представление о важности отдельных элементов регуляторной области может быть получено на основе сравнительного анализа регуляторных областей ортологичных генов у родственных видов. Было известно, что спектры тканеспецифичности экспрессии генов RFP2 человека и мыши сходны , что позволяло надеяться на большее понимание механизмов регуляции тканеспецифичности этого гена при сравнительном анализе структур его регуляторных областей у двух видов. Структура кодирующей области мышиного ортолога гена RFP2 человека была известна, однако регуляторная область не была секвенирована к началу данной работы, что и определило постановку данной цели исследования.

Таким образом, данная работа посвящена актуальной задаче изучения и сравнительного анализя регуляторных областей гена RFP2 у человека и мыши. Работа проводилась в рамках плановой тематики ИОГен РАН и поддерживалась грантами российских программ «Геном человека» и «РФФИ».

Научно-практическая значимость работы

Одной из областей генома человека, предположительно участвующих в супрессии опухолевого фенотипа является область 13ql4.3. В составе этой области выявлено несколько генов, которые как предполагается, могут выполнять функцию гена-супрессора опухолевого роста. Одним из наиболее вероятных генов-кандидатов в области 13ql4 является ген RFP2. Мутационный анализ белок-кодирующих участков этого гена не выявил соматических мутаций у больных хроническим лимфолейкозом - тем не менее, именно в этой группе больных утрата области генома 13ql4 является наиболее частой (до 80% в некоторых выборках) . Одной из возможных мишеней для мутаций, инактивирующих ген, является его регуляторная область. Для проведения мутационного анализа этой области у больных необходимо знание ее структуры и принципов ее регуляции в норме. Структура промоторной области в случае гена RFP2 человека была неизвестна к началу данной работы, хотя первая версия черновой последовательности генома человека к тому времени уже была доступна. Кроме того, структура регуляторнои области гена влияет на тканевый спектр его экспрессии. Поэтому информация о структуре регуляторнои области опухолевых супрессоров, необходима для понимания молекулярных механизмов возникновения и прогрессии опухолей, ассоциированных с утратой области 13ql4, в том числе множественной миеломы и карциномы простаты .

Принципы регуляции экспрессии генов у эукариот Основные элементы

Промоторный участок является основным регуляторным районом гена, принципиально важным для его правильного функционирования. С этой последовательности нуклеотидов с помощью РНК-полимеразы начинается синтез РНК. У высших эукариот, в том числе и у человека существуют три РНК-полимеразы: I, II и III. Каждая из них распознает свой набор промоторов и, тем самым, транскрибирует свой набор генов [Патрушев, 2000].

РНК-полимераза I транскрибирует рибосомальные гены (18S, 5.8S и 28S), представленные сотнями повторяющихся копий, разделенных спейсерами. Промоторы РНК-полимеразы I содержат два базальных регуляторных элемента (CPE - core promoter element), локализованных между положениями - 75 и -50, а также -30 и +1. Последовательность СРЕ обеспечивает специфичность транскрипции генов рРНК, и присутствие её достаточно для инициации.

Спейсеры, разделяющие рибосомальные гены, соответствуют по своим свойствам промоторам, однако, несмотря на то, что в них удается выявить минимальные участки с промоторной активностью, к сожаленью вывести для них консенсусную последовательность оказалось пока невозможным. Надо сказать, что в конце каждого спейсера находится сайт терминации размером 5 нуклеотидов, который отвечает также и за реинициацию нового транскрипта. При высвобождении транскрипта полимераза I остаётся связанной с ДНК и, в результате взаимодействия с дополнительным белковым фактором, тут же начинает следующий акт инициации транскрипции. Благодаря сопряжению актов терминации и инициации в одном сайте обеспечивается высокая эффективность процесса транскрипции, поскольку каждый новый акт инициации не требует поиска промотора. РНК-полимераза III транскрибирует три класса генов: гены 5S рРНК, тРНК и гены, кодирующие малые ядерные РНК. Транскрипция этих генов не зависит от последовательностей, расположенных перед ними, а определяется промотором, который лежит внутри этих генов (Shenk Т., 1981). В случае генов тРНК, промотор состоит из двух блоков, разделенных отрезком ДНК длиной около 20 п.н. Первый блок начинается через 8-30 п.н. после точки инициации транскрипции и представлен видеконсенсусной последовательности TGGCNNAGTGG. Второй блок начинается в позициях (+51 -+72) и имеет консенсус - GGTTCGANNCC. РНК полимераза II транскрибирует самый большой (более 40 тысяч) и самый разнообразный класс РНК - матричные РНК (мРНК), а также некоторые малые РНК (миРНК). Из трех РНК полимераз полимераза II является самой доступной для регуляции. Промоторы, узнаваемые РНК полимеразой II чрезвычайно многообразны. Длина их варьируется от нескольких сотен до нескольких тысяч пар оснований. Сама по себе РНК полимераза II не способна к связыванию с ДНК и инициации транскрипции. По сути, все промоторы РНК полимеразы П являются уникальными, так как включают в себя множество различных комбинаций сайтов посадки регуляторных факторов. Регуляторные факторы связываются с генами в районе, соответсвующем их факторов. Энхансеры, напротив, могут быть удалены от старта транскрипции на большое расстояние, до 60 тысяч пар оснований, их находят и в 5 -концевых и в З -концевых участках генов, энхансеры могут перекрываться как с экзонами, так и с интронами.

Если элементы базального промотора определяют точку начала транскрипции, то регуляторные проксимальные и другие элементы увеличивают частоту (или вероятность), с которой транскрипция инициируется, а также определяют тканеспецифический спектр экспрессии транскрипта.

До недавнего времени было очень мало известно в целом о альтернативных промоторах. В литературе было описано более 200 альтернативных промоторов, что позволяет представить, как выглядит механизм этого явления.

Вклад альтернативных промоторов в разнообразие транскриптома оценен по анализу базы данных полноразмерных клонов мыши. В анализ входило порядка 21 тысячи полноразмерных траскриптов, и по проведенному анализу их первых 5 альтернативных экзонов было выявлено около 9% генов имеющих альтернативный промотор .

Подобная работа была сделана и на транскриптоме человека. В компьютерный анализ были взяты 67 тысяч мРНК, кластеризующихся в 18 тысяч локусов . Анализ выявил, что порядка 18% генов имели альтернативное затравление.

В последнее время были найдены так называемые двунаправленные промоторы, способные направлять транскрипцию генов, расположенных на двух разных цепях ДНК. Конечно, одновременная транскрипция с комплементарных нитей ДНК с одного и того же участка при участии двух комплексов РНК-полимеразы II невозможна вследствие огромных размеров транскрипционной машины.

Комплексы, собираемые на разных цепях ДНК, могут конкурировать между собой, или же направление работы промотора может быть тканеспецифичным.

Сравнение регуляторных частей у гомологичных генов

Первые результаты сравнения генома человека и чернового варианта генома мыши показали, что в результате такого подхода можно извлечь очень большое количество информации и значительно облегчить процесс поиска генов. Сравнение 70 млн. п.н. хромосомы 19 человека со схожими последовательностями в геноме мыши выявило 12000 консервативных элементов, в том числе ранее не выявленные экзоны, целые гены, а также 4000 предполагаемых регуляторных элементов. Было также показано, что практически все гены хромосомы 19 человека, содержащиеся в геноме в виде единичных копий, имеют свои ортологи в геноме мыши и, кроме того, ортологичные гены сходно организованы в родственных геномах . В то же время, были найдены и примеры значительных структурных и регуляторных различий между генами-ортологами , в том числе такие различия были показаны для генов, кодирующих факторы транскрипции с «цинковыми пальцами», обонятельные рецепторы, рецепторы феромонов, сериновые протеазы и др. Заметно различающиеся гены часто организованы в кластеры, нередко содержащие тандемные повторы, соответствующие отдельным доменам или цельным генам в составе кластера. Благодаря присутствию повторяющихся участков кластеры генов в процессе эволюции быстрее накапливают хромосомные перестройки, в том числе дупликации и делеции, что приводит к появлению крупных структурных отличий, возникающих в процессе расхождения эволюционных ветвей, ведущих к человеку и к мыши.

В декабре 2001 года были опубликованы первые данные сравнительного анализа двух полных геномов млекопитающих - мыши и человека . Несмотря на то, что цитогенетический анализ позволил сделать заключение о многочисленных хромосомных перестройках, произошедших за это время и приведших к перетасовкам хромосомных фрагментов в составе геномов мыши и человека, сравнительный анализ этих геномов выявил 217 протяженных синтенных хромосомных участков (блоков синтении), покрывающих 90,2% генома человека и 93,3% генома мыши. Разница между двумя последними цифрами отчасти объясняется разницей в длине геномов -геном мыши на 14% короче генома человека . Степень консервативности синтенных блоков заметно варьирует от хромосомы к хромосоме. Так, хромосома X представлена одним блоком синтении, человеческая хромосома 20 полностью соответствует части мышиной хромосомы 2, причем для всех частей хромосомы за исключением небольшого центрального сегмента сохранен порядок следования консервативных маркеров. Человеческая хромосома 17 также соответствует части хромосомы 11 мыши, однако в данном случае большое количество хромосомных перестроек привело к образованию 16 отдельных сегментов, изменивших свое расположение друг относительно друга. С учетом инверсий и перестановок хромосомных фрагментов в составе блоков синтении, эти блоки во многих случаях можно подразделить на более мелкие синтенные участки (сегменты), общим числом 342.

Интересные наблюдения были сделаны при сравнительном анализе нуклеотидного состава двух геномов. Так, по общему содержанию нуклеотидов G и С в геноме человек и мышь различаются несущественно (41% нуклеотидов G и С в составе генома человека и 42% - в геноме мыши). Однако, оказалось, что в геноме человека 1,4% «окон» размером 20 т.п.н. содержат более 56% нуклеотидов G и С, а 1,3% «окон» - менее 33% G и С, в то время как в геноме мыши «окна» с таким экстремально высоким и экстремально низким содержанием указанных нуклеотидов отсутствуют. Геном мыши содержит гораздо меньше CpG-островков, чем геном человека - 15500 против 27000, что напрямую связано с регуляцией.

Преимущества сравнительной геномики для выявления регуляторных последовательностей неоднократно показывались в разных теоретических и экспериментальных работах Так было доказано, что эволюционно-консервативные последовательности, фланкирующие 1-й экзон гена ВТК, содержат регуляторные элементы, обуславливающие специфическую экспрессию этого гена .

Наиболее показательным примером является крупномасштабный проект Genomatix (http://www.genomatix.de/), в котором были экспериментально выявлены с помощью микрочипов промоторные регионы всех на данный момент известных генов человека и мыши. Большая часть этих промоторных регионов (порядка 6 тысяч) была выявлена с помощью сравнительной генетики.

Транскрипционный фактор, кодируемый геном Oct4, экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках и половых клетках мышиных эмбрионов, но отсутствует в дифференцированных соматических клетках. Предпринятый анализ промоторной последовательности гена Oct4 выявил область минимального промотора, не содержащего ТАТА-box, и два возможных энхансера - дистальный и проксимальный, но не позволил однозначно судить о механизмах регуляции специфической экспрессии этого гена. Секвенирование 5 -области человеческого гомолога гена ОСТ4 и последующее сравнение соответствующих последовательностей у человека и мыши показало наличие в предполагаемых регуляторных последовательностях четырех консервативных участков (CR1-4) со степенью сходства 66% - 99%. При дальнейшем изучении этих участков, оказавшихся консервативными также и в геноме быка, в них были обнаружены сайты узнавания транскрипционных факторов Spl/Sp3 и элемент HRE (hormone responsive element) .

Установление структуры гена мыши Щр2

Следующим этапом было выяснение структуры промотора и определение механизмов регуляции гена Rfp2 мыши. В случае сходства структуры промоторов генов-ортологов RFP2 у мыши и человека, мышь можно было бы использовать в качестве модельного организма для дальнейшего глубоко изучения регуляции гена RFP2, тем более что в результате более ранней работой выполненной в лаборатории анализа генома ИОГен РАН было показано, что спектр тканеспецифичности экспрессии гена RFP2 у человека и мыши является сходным.

На момент начала работы о структуре генома мыши в области RFP2 ничего не было известно. Мышиный гомолог Rfp2 расположен на 14-й хромосоме мыши в области, синтенной району 13ql4.3 человека. Ранее в нашей лаборатории на основе анализа базы данных dbEST была установлена in silico структура человеческого гомолога гена Rfp2 мыши . В результате были описаны три изоформы мРНК мышиного гена Rfp2 на основе перекрывающихся клонов кДНК АА499774, BF714458, ВВ575397, BG079221 и BF714459. Все они имеют высокую степень сходства с человеческим геном в кодирующей области. Компьютерный анализ показал, что аминокислотные последовательности продуктов человеческого и мышиного генов имеют одинаковую длину и содержат 86% идентичных позиций и всего 8% неэквивалентных замен. В то же время, 5 -нетранслируемые области мышиных изоформ составленных in silico не были гомологичны человеческим последовательностям, имеющимися в базах данных GenBank и dbEST.

Первым этапом этой части работы было экспериментальное доказательство существования выявленных in silico изоформ РНК мышиного ортолога гена Rfp2. Для этого мы провели ПНР на продуктах обратной транскрипцией на тотальной РНК мыши (ОТ-ПЦР) на праймерах указанных в таблице 4.

Результаты этого эксперимента приведены на рис.П. Полученные амлификаты были заклонированы в вектор pGEMT-easy, и затем были определены их нуклеотидные последовательности. Таким образом, нам удалось подтвердить существование двух изоформ мРНК у этого гена -IF1 и IF2. Обе эти изоформы в своей 5 нетранслируемой части имеют два альтернативных первых экзона и один общий второй.

Следующим этапом было проведение компьютерного анализа областей перед двумя первыми экзонами гена RFP2 мыши. Анализ нуклеотидных последовательностей показал среднее содержание GC нуклеотидов в промоторной области - около 60%. Нами было выявлено два регуляторных элемента перед экзоном 1а: ТАТА-бокс за 23 п.н. от точки инициации транскрипции (CTTTTTATAGC) и GC-бокс за 158 п.н. (TGGGTGGCCC). В непосредственной близости от второго экзона каких-либо регуляторных элементов обнаружено не было. Анализ плотности распределения сайтов посадки транскрипционных факторов также не выявил дисбаланса между двумя цепями ДНК.

На момент начала работы о структуре генома мыши в области Rfp2 ничего не было известно, она появилась в ходе данной работы в 2002 . Проведенное нами сравнение генома человека и мыши в области гена RFP2 показал, что в этом районе проходит граница синтении, расположенная перед кодирующим экзоном. Таким образом, оказалось, что область промотора и первых двух экзонов гена RFP2 у человека и мыши не имеет протяженных областей гомологии.

В то же время важно отметить, что спектр тканеспецифичности экспрессии этого гена у человека и мыши остается сходным . Из этого следовало, что при сравнении промоторных областей гена RFP2 у человека и мыши могут быть обнаружены одинаковые регуляторные элементы.

Мы провели сравнительный анализ особенностей промоторных областей гена RFP2 у мыши и человека с целью выявления общих и различных регуляторных элементов:

Промоторная область гена RFP2 человека имеет очень высокий GC-состав - 72% по сравнению с мышиным гомологом 60%. Также в промоторной области гена RFP2 человека локализована область с повторами типа GnA, способными образовывать такие сложные вторичные структуры как квадруплексы, играющие роль в регуляции транскрипции. 2) Регуляторные элементы Как уже было выше сказано, в промоторной области гена RFP2 человека не было обнаружено ТАТА-бокса, но найдено два GC-бокса. У мышиного гомолога перед экзоном изоформы ГРІ были обнаружены и ТАТА-бокс и GC-бокс. 3) Характер распределения транскрипционных факторов в промоторной области У гена RFP2 человека выявлен дисбаланс плотности распределения сайтов посадки транскрипционных факторов между комплементарными цепями ДНК, и определены семейства факторов вносящих основной вклад в это распределение - IKAROS, SP1, CETS1P54. У гена Rfp2 мыши наблюдалось равномерное распределение плотностей сайтов посадки транскрипционных факторов. 4) Альтернативный сплайсинг 5 -нетранслируемых частей У гена RFP2 человека зарегистрировано три изоформы образующихся в результате альтернативного сплайсинга первых двух нетранслируемых экзонов. Мышиный гомолог данного гена кодирует две изоформы мРНК, IF1 и ГБ2, каждая из которых имеет свой промотор. 5) Антисенс регуляция Антисенс-транскрипт к гену RFP2 человека был клонирован ранее в лаборатории анализа генома ИОГен РАН. Для гомолога мыши Rfp2 антисенс транскрипта обнаружено не было. Как видно, ген RFP2 человека имеет очень сложную и абсолютно не похожую регуляцию по сравнению с мышиным ортологом. Использование мыши в качестве модельного организма для исследования регуляции гена RFP2 не является обоснованным.

Зайцева, Юлия Владимировна

Чтобы сузить результаты поисковой выдачи, можно уточнить запрос, указав поля, по которым производить поиск. Список полей представлен выше. Например:

Можно искать по нескольким полям одновременно:

Логически операторы

По умолчанию используется оператор AND .
Оператор AND означает, что документ должен соответствовать всем элементам в группе:

исследование разработка

Оператор OR означает, что документ должен соответствовать одному из значений в группе:

исследование OR разработка

Оператор NOT исключает документы, содержащие данный элемент:

исследование NOT разработка

Тип поиска

При написании запроса можно указывать способ, по которому фраза будет искаться. Поддерживается четыре метода: поиск с учетом морфологии, без морфологии, поиск префикса, поиск фразы.
По-умолчанию, поиск производится с учетом морфологии.
Для поиска без морфологии, перед словами в фразе достаточно поставить знак "доллар":

$ исследование $ развития

Для поиска префикса нужно поставить звездочку после запроса:

исследование*

Для поиска фразы нужно заключить запрос в двойные кавычки:

" исследование и разработка"

Поиск по синонимам

Для включения в результаты поиска синонимов слова нужно поставить решётку "# " перед словом или перед выражением в скобках.
В применении к одному слову для него будет найдено до трёх синонимов.
В применении к выражению в скобках к каждому слову будет добавлен синоним, если он был найден.
Не сочетается с поиском без морфологии, поиском по префиксу или поиском по фразе.

# исследование

Группировка

Для того, чтобы сгруппировать поисковые фразы нужно использовать скобки. Это позволяет управлять булевой логикой запроса.
Например, нужно составить запрос: найти документы у которых автор Иванов или Петров, и заглавие содержит слова исследование или разработка:

Приблизительный поиск слова

Для приблизительного поиска нужно поставить тильду "~ " в конце слова из фразы. Например:

бром~

При поиске будут найдены такие слова, как "бром", "ром", "пром" и т.д.
Можно дополнительно указать максимальное количество возможных правок: 0, 1 или 2. Например:

бром~1

По умолчанию допускается 2 правки.

Критерий близости

Для поиска по критерию близости, нужно поставить тильду "~ " в конце фразы. Например, для того, чтобы найти документы со словами исследование и разработка в пределах 2 слов, используйте следующий запрос:

" исследование разработка"~2

Релевантность выражений

Для изменения релевантности отдельных выражений в поиске используйте знак "^ " в конце выражения, после чего укажите уровень релевантности этого выражения по отношению к остальным.
Чем выше уровень, тем более релевантно данное выражение.
Например, в данном выражении слово "исследование" в четыре раза релевантнее слова "разработка":

исследование^4 разработка

По умолчанию, уровень равен 1. Допустимые значения - положительное вещественное число.

Поиск в интервале

Для указания интервала, в котором должно находиться значение какого-то поля, следует указать в скобках граничные значения, разделенные оператором TO .
Будет произведена лексикографическая сортировка.

Такой запрос вернёт результаты с автором, начиная от Иванова и заканчивая Петровым, но Иванов и Петров не будут включены в результат.
Для того, чтобы включить значение в интервал, используйте квадратные скобки. Для исключения значения используйте фигурные скобки.

Молекулярная биология

Лекция 3. Функции нуклеиновых

кислот. Часть 1.

Скоблов Михаил Юрьевич

Часть 1. История исследования

функции ДНК

Происхождение ДНК

Внеземное?

Эксперимент Миллера - Юри

Ученые из NASA проанализировали состав

12 богатых углеродом метеоритов, 9 из

которых найдены в Антарктике. В них были

обнаружены компоненты ДНК такие как

аденин, гуанин, а также и другие

Теория химической эволюции

клеточные компоненты - гипоксантин и

История изучения ДНК

В 1869 году Фридрих Мишер обнаружил неизвестное соединение, содержащееся в ядрах клеток, и назвал его нуклеином, от латинского nucleus - ядро.

Эксперимент Эвери, Маклеода и Маккарти по трансформации бактерий. 1944 г.

История изучения ДНК Эксперимент Эвери, Маклеода и Маккарти по трансформации бактерий. 1944 г.

Вторая серия…..

Вывод:

Только ДНК определяет наследственные свойства организма.

Реализация ДНК как генетического материала У каждого живого организма есть наследственный материал Реализация ДНК как генетического материала Размер генома человека 3,2x109 нуклеотидных пар, из него около 1.5% генома кодирует белки А остальное?

Реализация ДНК как генетического материала Прокариоты и вирусы Плотность генов,ген/тыс.нукл.

Эукариоты Размер генома, тыс. нукл.

Реализация ДНК как генетического материала Гены организованы по разному: Размер генома человека 3,2x109 нуклеотидных У прокариот: пар, из него около 30% генома кодирует гены Ген А кодирующие белки А остальное?

мРНК гена А “junk DNA”?

У эукариот:

Ген А мРНК гена А Реализация ДНК как генетического материала

Парадокс:

С эволюционной сложностью организма растёт и доля ДНК не кодирующей белки… Реализация ДНК как генетического материала Структура генома человека Информационная емкость ДНК Демонстрация записи текста целой книги Чёрча в 1 пикограмм молекул.

– – –

Информационная плотность записи 2,2 петабайта на 1 грамм биологического материала.

На сегодняшний день стоимость кодирования информации в ДНК оценивается примерно в $12400 за мегабайт, стоимость считывания - $220 за 1 МБ.

Часть 2. Функции ДНК Анализ первичной структуры ДНК и её функции

– – –

Полученные данные позволяют провести фактически полноценный анализ по исследованию регуляции изучаемого локуса.

Найти ген – значит картировать РНК на ДНК, Гены проаннотировать эту последовательность.

«Ген – это совокупность геномных последовательностей, кодирующих сцепленный набор потенциально перекрывающихся функциональных продуктов».

Гены Псевдогены. Классификация.

– – –

Образованы 10% кодирующих генов

Около 80% примато-специфичные

Значительная фракция псевдогенов (до 20%) транскрипционно активна… Механизмы действия процессированных псевдогенов Псевдогены и miRNA “PTEN is a functionally haploinsufficient tumour suppressor gene”.

– – –

Энхансер (enhancer) - последовательность ДНК, способный связываться с факторами транскрипции, при этом увеличивая уровень транскрипции гена или группы генов.

Сайленсер (silencer) - последовательность ДНК, с которой связываются факторы транскрипции (белки-репрессоры), что приводит к понижению или к полному подавлению транскрипции гена.

Инсулятор (insulator) - последовательность ДНК, способная блокировать взаимодействие между энхансером и промотором, если находится между ними.

Регуляторные участки в геноме Уровень экспрессии гена является результирующей всех взаимодействий.

Регуляторные участки в геноме

Проанализировано 19 тканей и типов клеток мыши

Найдено около 300 000 цис-регуляторных элементов

Они составляют до 11% генома мыши

И включают в себя более 70% консервативных не-кодирующих последовательностей Регуляторные участки в геноме

– – –

Однако сравнение их активного состояния в эмбриональных стволовых клетках мыши и человека показало, что только 25% процентов активных энхансеров и инсуляторов консервативны.

Повторяющиеся последовательности в ДНК

– – –

Gonzaga-Jauregui C, Lupski JR, Gibbs RA.

Human genome sequencing in health and disease.

Annu Rev Med. 2012;63:35-61.

Функционирование вторичной структуры ДНК Квадруплексы - последовательности нуклеиновых кислот, обогащенные гуанином и способные образовывать структуры из двух, трёх или четырех цепей.

В геноме человека насчитывается около 300 тысяч квадруплексов.

ДНКазимы

Впервые дезоксирибозимы были экспериментально продемонстрированы в 1994 Брикеро и Джойсом

Они использовали селекцию in vitro для поиска специфичных ДНК последовательностей способных катализировать Pb2+-зависимое расщепление фосфодиэфирной связи в РНК

Сегодня в литературе описано большое количество различных каталитических молекул ДНК способных расщеплять, лигировать, фосфорилировать деапуринизировать молекулы ДНК, метилировать порфирины, расщеплять и лигировать молекулы РНК.

Также в литературе описано несколько десятков случаев использования in vivo РНКрасщепляющих дезоксирибозимов для подавления экспрессии генов с ориентированием на будущий прикладной потенциал.

Скоблов михаил юрьевич. Структура и особенности регуляции генов гомологов RFP2 у человека и мыши Скоблов Михаил Юрьевич

Рекомендованный список диссертаций

Транскрипционная регуляция кластеров семенник-специфичных генов Stellate y Drosophila melanogaster 2015 год, кандидат биологических наук Оленкина, Оксана Михайловна

Определение и анализ регуляторных районов гена XIST полевки Microtus Rossiaemeridionalis 2011 год, кандидат биологических наук Орищенко, Константин Евгеньевич

Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов HERV-K (HML-2) и L1 2013 год, кандидат биологических наук Александрова, Елена Александровна

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и особенности регуляции генов гомологов RFP2 у человека и мыши»

Похожие диссертационные работы по специальности «Генетика», 03.00.15 шифр ВАК

Структура и функционирование 5"-регуляторной области гена NANOG восточно-европейской полёвки 2013 год, кандидат биологических наук Сорокин, Михаил Алексеевич

Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у Drosophila melanogaster 2013 год, доктор биологических наук Мельникова, Лариса Сергеевна

Функциональный анализ структурных элементов промотора гена udp Escherichia coli 2003 год, кандидат биологических наук Овчарова, Ирина Викторовна

Заключение диссертации по теме «Генетика», Скоблов, Михаил Юрьевич

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Скоблов, Михаил Юрьевич, 2004 год

Научно-практическая значимость работы

Принципы регуляции экспрессии генов у эукариот Основные элементы

Сравнение регуляторных частей у гомологичных генов

Установление структуры гена мыши Щр2

Логически операторы

Тип поиска

Поиск по синонимам

Группировка

Приблизительный поиск слова

Критерий близости

Релевантность выражений

Поиск в интервале